微生物測(cè)定的發(fā)展

      微生物生長(zhǎng)情況可以通過測(cè)定單位時(shí)間里微生物數(shù)量或生物量(biomass)的變化來評(píng)價(jià)。通過微生物生長(zhǎng)的測(cè)定可以客觀地評(píng)價(jià)培養(yǎng)條件、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響，或評(píng)價(jià)不同的抗菌物質(zhì)對(duì)微生物產(chǎn)生抑制(或殺死)作用的效果，或客觀地反映微生物生長(zhǎng)的規(guī)律。因此微生物生長(zhǎng)的測(cè)量在理論上和實(shí)踐上有著重要的意義。微生物生長(zhǎng)的測(cè)定有計(jì)數(shù)、重量和生理指標(biāo)等方法。

1、計(jì)數(shù)法

      此法通常用來測(cè)定樣品中所含細(xì)菌、孢子、酵母菌等單細(xì)胞微生物的數(shù)量。計(jì)數(shù)法又分為直接計(jì)數(shù)和間接計(jì)數(shù)兩類。

直接計(jì)數(shù)
      這類方法是利用特定的細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。此法的缺點(diǎn)不能區(qū)分死菌與活菌。計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，上面有一個(gè)特定的面積lmm2和高0.1mm的計(jì)數(shù)室，在1mm2的面積里又被刻劃成25個(gè)(或16個(gè))中格，每個(gè)中格進(jìn)一步劃分成16個(gè)(或25個(gè))小格，但計(jì)數(shù)室都是由400個(gè)小格組成。

      將稀釋的樣品滴在計(jì)數(shù)板上，蓋上蓋玻片，然后在顯微鏡下計(jì)算4-5個(gè)中格的細(xì)菌數(shù)，并求出每個(gè)小格所含細(xì)菌的平均數(shù)，再按下面公式求出每毫升樣品所含的細(xì)菌數(shù)。

      每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)＝每小格平均細(xì)菌數(shù)×400×l000×稀釋倍數(shù)

間接計(jì)數(shù)法
      又稱活菌計(jì)數(shù)法，其原理是每個(gè)活細(xì)菌在適宜的培養(yǎng)基和良好的生長(zhǎng)條件下可以通過生長(zhǎng)形成菌落。將待測(cè)樣品經(jīng)一系列10倍稀釋，然后選擇三個(gè)稀釋度的菌液，分別取0.2ml無菌平皿，再倒入適量的已熔化并冷至45℃左右的培養(yǎng)基，與菌液混勻、冷卻、待凝固后，放人適宜溫度的培養(yǎng)箱或溫室培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌落后，計(jì)數(shù)，按下面公式計(jì)算出原菌液的含菌數(shù)：

      每毫升原菌液活菌數(shù)＝同一稀釋度三個(gè)以上重復(fù)平皿菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×5

      此法可因操作不熟練造成污染，或因培養(yǎng)基溫度過高損傷細(xì)胞等原因造成結(jié)果不穩(wěn)定。盡管如此，由于該方法能測(cè)出樣品中微量的菌數(shù)，仍是教學(xué)、科研和生產(chǎn)上常用的一種測(cè)定細(xì)菌數(shù)的有效方法。土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含細(xì)菌、酵母、芽孢與孢子等的數(shù)量均可用此法測(cè)定。但不適于測(cè)定樣品中絲狀體微生物，例如放線菌或絲狀真菌或絲狀藍(lán)細(xì)菌等的營(yíng)養(yǎng)體等。

      除上述兩種常用的計(jì)數(shù)方法外，還有膜過濾法、比濁法。膜過濾法是當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時(shí)，可以將一定體積的潮水、海水或飲用水等樣品通過膜過濾器。然后將濾膜干燥、染色，并經(jīng)處理使膜透明，再在顯微鏡下計(jì)算膜上(或一定面積中)的細(xì)菌數(shù)；比濁法原理是在一定范圍內(nèi)，菌的懸液中細(xì)胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌越多，光密度越大。因此可以借助于分光光度計(jì)，在一定波長(zhǎng)下，測(cè)定菌懸液的光密度，以光密度(optical density，即O..D.)表示菌量。實(shí)驗(yàn)測(cè)量時(shí)一定要控制在菌濃度與光密度成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準(zhǔn)確。微生物計(jì)數(shù)法，發(fā)展迅速，現(xiàn)有多種多樣的快速、簡(jiǎn)易、自動(dòng)化的儀器和裝置等方法。

2、重量法
      此法的原理是根據(jù)每個(gè)細(xì)胞有一定的重量而設(shè)計(jì)的。它可以用于單細(xì)胞、多細(xì)胞以及絲狀體微生物生長(zhǎng)的測(cè)定。將一定體積的樣品通過離心或過濾將菌體分離出來，經(jīng)洗滌，再離心后直接稱重，求出濕重，如果是絲狀體微生物，過濾后用濾紙吸去菌絲之間的自由水，再稱重求出濕重。不論是細(xì)菌樣品還是絲狀菌樣品，可以將它們放在已知重量的平皿或燒杯內(nèi)，于105℃烘干至恒重，取出放人干燥器內(nèi)冷卻，再稱量，求出微生物干重。

      如果要測(cè)定固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的放線菌或絲狀真菌，可先加熱至50℃，使瓊脂熔化，過濾得菌絲體，再用50℃的生理鹽水洗滌菌絲，然后按上述方法求出菌絲體的濕重或干重。

      除了干重、濕重反映細(xì)胞物質(zhì)重量外，還可以通過測(cè)定細(xì)胞中蛋白質(zhì)或DNA的含量反映細(xì)胞物質(zhì)的量。蛋白質(zhì)是細(xì)胞的主要成分，含量也比較穩(wěn)定，其中氮是蛋白質(zhì)的重要組成元素。從一定體積的樣品中分離出細(xì)胞，洗滌后，按凱氏定氮法測(cè)出總氮量。蛋白質(zhì)含氮量為16%，細(xì)菌中蛋白質(zhì)含量占細(xì)菌因形物的50%一80%，一般以65%為代表，有些細(xì)菌則只占13%一14%，這種變化是由菌齡和培養(yǎng)條件不同所產(chǎn)生的。因此總含氮量與蛋白質(zhì)總量之間的關(guān)系可按下列公式計(jì)算：

      蛋白質(zhì)總量＝含氮量×6.25
      細(xì)胞總量＝蛋白質(zhì)總量÷(50%～80%(或65%))≈蛋白質(zhì)總量×1.54

      核酸DNA是微生物的重要遺傳物質(zhì)，每個(gè)細(xì)菌的DNA含量相當(dāng)恒定，平均為8.4×10-5ng.因此從一定體積的細(xì)菌懸液中所含的細(xì)菌中提取DNA，求得DNA含量，再計(jì)算出這一定體積的細(xì)菌懸液所含的細(xì)菌總數(shù)。

3、生理指標(biāo)法
      對(duì)于一些非真溶液的樣品，要測(cè)定微生物數(shù)量除了用活菌計(jì)數(shù)法外，還可以用生理指標(biāo)測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。生理指標(biāo)包括微生物的呼吸強(qiáng)度、耗氧量、酶活性、生物熱等。這是根據(jù)微生物在生長(zhǎng)過程中伴隨出現(xiàn)的這些指標(biāo)，樣品中微生物數(shù)量多或生長(zhǎng)旺盛，這些指標(biāo)愈明顯，因此可以借助特定的儀器如瓦勃氏呼吸儀、微量量熱計(jì)等設(shè)備來測(cè)定相應(yīng)的指標(biāo)。這類測(cè)定方法主要用于科學(xué)研究，分析微生物生理活性等。